De invloed van hemolymfe van bijenlarven op de expressie van potentiële virulentiegenen van Paenibacillus larvae

Bijensterfte: goed of slecht nieuws?

Berichten over massale bijensterfte duiken al enige tijd regelmatig op in het nieuws. De reacties daarop lopen sterk uiteen. Mensen die geen onderscheid maken tussen bijen en wespen, vinden dat waarschijnlijk een goede zaak. Wie wel het verschil kent, stelt zich terecht vragen. Bijen vervullen immers een zeer belangrijke rol in de bestuiving van zaadplanten en vormen op die manier een onmisbare schakel in onze voedselketen. Het is van het hoogste belang de verschillende oorzaken van de bijensterfte te achterhalen en uit te schakelen. In mijn thesis bestudeerde ik de bacterie die Amerikaans vuilbroed verwekt, een ziekte die larven van de bijen aantast.

Bestuiving is een biologisch proces waarbij stuifmeelkorrels uit de helmhokjes van de meeldraden overgebracht worden naar de stempel van de stamper. Dit proces is noodzakelijk om de plant te bevruchten, waarna nieuwe vruchten (bv. fruit) gevormd worden. Bestuiving kan zowel volbracht worden door dieren (o.a. insecten en vogels) als door de wind of door water. Bij veel voedselgewassen (vnl. groenten en fruit) en wilde planten gebeurt de bestuiving door dieren. De insecten hebben daarin het grootste aandeel. De economische waarde van de bestuiving van gewassen door insecten bedraagt ongeveer 153 miljard euro. Aangezien dat 10% is van de waarde van de wereldvoedselproductie, zijn bestuivende insecten van levensbelang voor de menselijke voedselvoorziening. Van de insecten zijn de bijen wereldwijd de belangrijkste bestuivers. Zij zijn immers voor hun voeding volledig afhankelijk van bloemen, waardoor ze dus heel veel bloemen bezoeken en tegelijkertijd voor bestuiving zorgen. Het stuifmeel is namelijk de eiwit- en mineralenbron voor de bij, terwijl de nectar hun suikerbron is.

Het succes van bijen is mede te danken aan hun grote aantallen, een strikte taakverdeling en een goede communicatie. Met velen samenleven op een kleine plaats leidt echter tot een groot risico op infectie. De pathogeen (o.a. bacteriën en virussen) kan zich namelijk gemakkelijk verspreiden en zo tot grote economische verliezen leiden. Immers, minder bijen betekent minder bestuiving en dus minder opbrengst in o.a. land- en tuinbouw. Kennis over de manier waarop pathogenen de gezondheid van de bij aantasten is essentieel om de ziekten te kunnen behandelen en/of te voorkomen. Mijn thesis kadert binnen een doctoraat dat o.a. de virulentiegenen van Paenibacillus larvae wil identificeren. Deze bacterie is de verwekker van Amerikaans vuilbroed, een ziekte die leidt tot sterfte van de larven van de bij. Wanneer virulentiegenen aangezet worden leiden ze tot de productie van virulentiefactoren en dat zijn bv. toxines, adhesines (belangrijk voor de vasthechting van de pathogeen aan de gastheer). De pathogeen maakt gebruik van die virulentiefactoren om ziekte te veroorzaken. De identificatie van de virulentiegenen is een eerste belangrijke stap in de zoektocht naar controle- en behandelingsmethoden van Amerikaans vuilbroed.

Het genoom van P. larvae is sinds kort gekend. Met behulp van bio-informatica analyses werden meer dan 200 mogelijke virulentiegenen geïdentificeerd. Dit is echter slechts een voorspelling en d.m.v. labo experimenten moet nagegaan worden of deze genen inderdaad een rol spelen bij de infectie van larven van de bij. Er zijn reeds verschillende studies gekend, waarbij men virulentiegenen van pathogenen geïdentificeerd heeft, doordat ze sterker of zwakker aangezet werden in de aanwezigheid van gastheerweefsels. In geval van P. larvae betekent dit dat de virulentiegenen sterker of zwakker aangezet worden in de aanwezigheid van hemolymfe (= bloed) van bijenlarven, aangezien dit een gastheerweefsel is voor P. larvae.

Kwantitatieve PCR (Q-PCR) en micro-arrays worden meer en meer gebruikt om na te gaan of genen sterker of zwakker aangezet worden in verschillende condities. Met behulp van micro-arrays kan van duizenden genen (bv. al de genen van P. larvae) tegelijkertijd bepaald worden hoe sterk of zwak ze aanstaan. Q-PCR daarentegen bepaalt hoe sterk of zwak een beperkt aantal genen aanstaat. Deze techniek is nauwkeuriger dan micro-array. Een micro-array analyse geeft snel een indicatie van welke genen sterker of zwakker aanstaan in aanwezigheid van hemolymfe en met Q-PCR kan je nadien nauwkeurig bepalen hoeveel het gen meer of minder aanstaat. Een micro-array experiment is echter duur en daarom hebben we besloten om eerst de optimale condities voor het micro-array experiment na te gaan met een Q-PCR experiment. Q-PCR werd nu dus uitzonderlijk ook voor het micro-array experiment reeds gebruikt en zal ook na het micro-array experiment gebruikt worden om exact te bepalen hoeveel sterker of zwakker de genen aanstaan.

Ten eerste heb ik een antwoord gezocht op een aantal essentiële vragen waaronder o.a.:

1. In welk vloeibaar medium (J-, BHIT- of MYPGP- medium) groeit P. larvae het best? Deze media hebben een verschillende samenstelling van voedingsstoffen. Afhankelijk van welke voedingsstoffen P. larvae het best kan gebruiken, zal de bacterie beter groeien in het ene medium t.o.v. het andere.
2. Hoeveel uur nadat we hemolymfe toegevoegd hebben aan de bacteriecultuur, zullen we bepalen hoe sterk de mogelijke virulentiegenen aanstaan?

Nadat ik een antwoord gevonden had op deze en nog meer vragen, waren de condities voor het Q-PCR experiment gekend. We besloten om P. larvae te groeien in BHIT-medium en nadat de bacterie voldoende gegroeid was, werd de cultuur in twee gesplitst. Vervolgens werd aan één cultuur hemolymfe en aan de andere PTU (de controlecultuur) toegevoegd. Dit houdt in dat beide culturen identiek waren, het enige verschil was de aan- of afwezigheid van hemolymfe. Een verschil in de sterkte waarin de genen aanstonden, is dus uitsluitend het gevolg van hemolymfe. Eén uur, 3 uur en 9 uur na het toevoegen van hemolymfe en PTU werd er een staal genomen van beide bacterieculturen. D.m.v. Q-PCR werd bepaald hoe sterk de tien mogelijke virulentiegenen op de drie tijdstippen aanstonden.

Ondanks dat slechts een klein aantal mogelijke virulentiegenen getest werden in deze studie (slechts 10 van de meer dan 200), werd toch een duidelijk verschil vastgesteld in de mate waarin de genen aanstonden in aan- en afwezigheid van hemolymfe (na 1 uur stonden vijf genen minder sterk aan in de aanwezigheid van hemolymfe en één gen stond sterker aan; na 3 uur stond één gen minder sterk aan en drie genen stonden sterker aan; na 9 uur stond geen enkel gen minder sterk aan en vijf genen stonden sterker aan). Aangezien de gebruikte omstandigheden (gekozen medium, tijdstippen, ...) leidden tot een verschil in de mate waarin de onderzochte genen aanstonden, was de conclusie van mijn thesis dat deze condities ook gebruikt kunnen worden voor de micro-array analyse die in de toekomst uitgevoerd zal worden.